CRISPR-Cas9基因编辑技术（sgRNA的设计----最全、最实用教程）！
热门免费资源
一、国自然类：
7 更多资源在更新中.....
4 国自然热点培训课
二、SCI实验类：11 更多资源在更新中.....
6 近3年SCI实验资源汇总
10 SCI写作万能模板
三、科研绘图类：9 资源共享群
8 PS 2021 (Mac)安装包
10 相亲交友群
看步骤的请直接往文末翻，这里先给大家免费分享：
“Snapgene最全视频教程（含软件）”
资源截图如下：
“Snapgene最全视频教程（含软件）”
如下免费获取：
①长按下方二维码关注
②对话框输入关键词：Snapgene
CRISPR-Cas9基因编辑技术
一、来源：
CRISPR/Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，存在于大多数细菌和古生菌中。原核生物在遭到病毒入侵后，能够把病毒DNA的一小段提取出来并存储到自身基因组上的特定区域， 我们把这个区域称为CRISPR存储空间。当再次遇到病毒入侵时，原核生物能够根据存储的DNA片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。根据CRISPR/Cas系统的特性，科学家将其改造成了目前最高效的基因组编辑工具。
目前应用最广泛的CRISPR/Cas系统是来源于酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) 的CRISPR/Cas9系统。2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier证明CRISPR/Cas9系统可以在体外切割双链DNA [1]；2013年，张锋首次用CRISPR/Cas9系统在原核生物 (大肠杆菌) 中实现基因组编辑 [2]。
天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：SpCas9 (以下简称Cas9)、crRNA、tracrRNA。其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA(guide RNA)，gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列 (图1)。为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA [1]，并把其称为sgRNA (single-guide RNA) (图2)。
改造后的CRISPR/Cas9系统成为研究者做基因编辑的首选工具。Cas9蛋白要成功识别目标序列必须满足两个条件：(1) sgRNA的5'端20 nt和靶DNA之间碱基配对；(2) 靶DNA的3'端有合适的PAM序列。CRISPR/Cas9切割目标DNA后产生DSB (双链断裂)，DSB是一切基于核酸内切酶的基因编辑的基础，CRISPR/Cas9之所以颠覆了以往的基因编辑技术，就是因为只需要改变sgRNA的5'端序列即可重编程Cas9的序列特异性，设计和操作十分方便。
二、基因编辑原理：
和其它基于核酸内切酶的基因编辑技术类似，基于CRISRP/Cas9的基因编辑技术主要分为两个过程。首先，Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列，产生DNA双链断裂（特异性结合序列是PAM（NGG），PAM是cas9的特异性识别位点，cas9会在PAM上游的第三个碱基处进行切割。cas9蛋白有Ruvc结构域和HNH结构域，分别切割DNA上下两条链）。
然后，细胞内的DNA修复系统修复双链断裂，在修复的过程中实现DNA序列的改变 (图3)。DNA修复机制分为两类：同源重组 (HR) 和非同源末端连接 (NHEJ)。同源重组修复需要借助修复模板，可以实现精确可控的编辑；NHEJ修复不依赖修复模板，直接将两个DNA末端拼接，但在拼接的过程中会产生碱基插入或缺失 (indels)，形成移码突变，实现基因编辑 。
三、建立基因敲除细胞系：
sgRNA设计：
我这里以TWIST1为例，一步一步演示。首先由生物医学之家进入NCBI官网查询该基因的CDS序列：
把CDS序列复制粘贴到snapgene：
ctrl+a全选复制。然后我们同样从生物医学之家进入张实验室网站：
上面的NGG我们有在原理中讲过，不懂得再划到开始的部分看看。
提交之后稍微等等。把结果下载下来：
因此，我这里选择前面的三条：
这就是我们的sgRNA序列啦。随后我们要用它去构建两条单链oligo，然后让公司合成。最后，到我们手上之后，我们将每对oligo退火形成双链，形成双链之后。将其构建到空的质粒载体上（我这里用57818空载），再包装成病毒。随后感染细胞，敲除基因。
那首先我用下载57818质粒的图谱：
下载下来之后用snapgene打开，这里我选择BsmBI作为酶切位点：
而我的gRNA 1的序列如下（我这里以1为例，2和3也是一样）：
那第一步就是要找到互补链。如下操作：
所以我就找到了反向互补链：
接下来我就要将这段序列两端加上一些碱基，让它能与BsmBI酶切位点的粘性末端结合：
如上，我们就将上面的红色和下面的绿色比作为我们sgRNA的两条链即可，将其替换进去。如下，最终我们要发给公司这两条序列，然后我们自己收到序列之后再退火形成双链。
接下来，我们将我们的目的片段结合到质粒上去，并作图。我们如下操作先构建gRNA的图：
然后将gRNA序列替换掉酶切掉的序列，打开空载，选择切的两个酶位点：
这样我们就添加好了：
那为了好看，我们标记一下：
然后我们可以保存起来，因为以后我们还要送测序，确定质粒是不是就是这个序列。OK，这样，我们就做晚了，后期我们继续将如何构建病毒。
“Snapgene最全视频教程（含软件）”
如下免费获取：
①长按下方二维码关注
②对话框输入关键词：Snapgene